Кирилл В (vakhnenko) wrote,
Кирилл В
vakhnenko

Categories:

Как я изучал туберкулёзные бактерии

Десять лет назад я работал в IT. Сейчас я тоже работаю в IT. Но в середине декады моя карьера выдала неожиданный зигзаг, и в течении нескольких лет я был микробиологом. В числе прочего, я занимался исследованиями туберкулеза в лаборатории с третьим уровнем биологической безопасности (далее "BSL-3"). Всего этих уровней четыре, подробнее про них можно прочесть тут, например. Вкратце, BSL-1 это самый травоядный уровень, а BSL-4 самый крутой, где изучают вещи вроде эболы. Третий уровень это чума, туберкулез, Западный Нильский вирус, коронавирус SARS, и т.п.

И решил вот написать пост про тот период в моей жизни -- с упором на повседневные реалии работы в лаборатории BSL-3. Думаю, это может быть многим интересно в силу нынешних обстоятельств, особенно учитывая официально прозвучавшие на этой неделе обвинения со стороны американской администрации, что -де коронавирус SARS-CoV-2 мог вырваться из китайской лаборатории в Ухани из-за небрежности тамошнего персонала.


Как я дошел до жизни такой?

Началось всё в 2014, когда мне до смерти наскучило то, чем я тогда занимался, и я решил кардинально изменить жизнь. Сказано-сделано, я подал несколько заявлений на поступление в магистратуру, и осенью того же года переехал из Вашингтона в Бостон. В начале учебы мне надо было выбрать в моем универе лабораторию, в которой я буду делать диплом. Не буду долго бить себя копытом в грудь, но лабораторию занимающуюся конкретно туберкулезом я выбрал, дабы чуточку помочь своей исторической родине, ибо в России ситуация с туберкулёзом неприглядная, пусть и постепенно улучшающаяся. Магистратура моя была инженерной, но в той биологической лабе нужен был кто-то более-менее обученный статистическому анализу, моделированию, численным методам и основам программирования, так что я пришелся ко двору. Лаба на тот момент была совсем маленькая, всего четыре человека, так что кроме анализа данных я занялся и экспериментами, благо у меня уже был опыт работы в паре лабораторий, во времена моего бакалавриата.

Поначалу, правда, я работал не с туберкулезными палочками, а с бактериями M. smegmatis из того же семейства. У тех характеристики во многом схожи с туберкулезными бациллами, но при том уровень биологической безопасности для них всего лишь BSL-1, и размножаются они чуть ли не на порядок быстрей тубика (в благоприятных условиях деление раз в ~несколько часов, вместо ~дня) -- в общем, работать с ними не в пример легче. Вот мое тогдашнее рабочее место (плюс была общая на нашу лабу комната с микроскопами, и т.д.):



Разумеется, даже в BSL-1 надо озадачиваться стерильностью -- но в основном всё ограничивалось одноразовыми перчатками, протиранием рабочего места (либо 10% раствором отбеливателя, либо 70% раствором алкоголя), работой при включенной бунзеновской горелке (пламя создает небольшую сферу, где в воздухе болтается меньше микроорганизмов), и тому подобными мерами. К слову, нас сильно гоняли когда кто-то ходил по коридорам в обеих перчатках, ибо касаться перчаткой дверной ручки, которую потом другие трогают незащищенными руками -- серьезное нарушение техники безопасности.

Через какое-то время, моя начальница решила до кучи научить меня ставить эксперименты с самим туберкулезом, ибо с M. smegmatis у меня получились весьма интересные результаты. Статью за моим авторством даже удалось опубликовать в Вестнике академии наук США (PNAS), что весьма недурно для инженеришки с магистратуры -- так что после этого возникло естественное желание провести тот же эксперимент с бактериями туберкулеза. Пришлось научиться работать в BSL-2 (например, экспериментируя над бактериями БЦЖ, которые используются в прививках против туберкулеза), и в BSL-3.

Входим в BSL-3

Театр начинается с вешалки, а наша BSL-3 лаборатория начинается с этого сканера отпечатка ладони. Вкладываешь магнитную карту-пропуск в прозрачный желоб на правой части сканера, прикладываешь ладонь к поверхности, и компьютер сравнивает картину электрического сопротивления ладони с тем, что у него заложено в памяти.



Магнитную карту (на которой есть имя и фотография) мы оставляли в специальной позрачной папке, висящей на внутренней стороны внешней двери -- чтобы было сразу понятно, есть ли кто-то внутри. По протоколу, надо было всегда держать в известности о своей работе в BSL-3 кого-то из членов нашей лаборатории, ибо зачастую ты в том помещении один, и сама BSL-3 при том находится на полупустом этаже. Так что если ближе к вечеру споткнешься и неудачно упадешь, то в лучшем случае найдут уже следующим утром. Более того, полиция или парамедики даже не имеют права туда входить, это должен делать кто-то, прошедший соответствующее обучение и имеющий доступ.

К слову, вид с того этажа небезинтересный:



После входа надо надеть защиту в эдаком "тамбуре". На схеме ниже тот отмечен цифрой 2 (а 1 это дверь, которая открывается отпечатком ладони). Пардон за низкое разрешение, лучше не нашлось.



Как надевать защиту, по порядку:

1) Надеваем одноразовые перчатки, доходящие примерно до середины запястья.

2) Надеваем поверх одежды костюм из тайвека, со вшитыми бахилами и капюшоном. Костюмы эти мы использовали по несколько раз.



3) Перчатки приматываются по окружности липкой лентой к рукавам костюма, чтобы во время работы не оголялись запястья. Меня, кстати, в свое время слегка насмешил первый эпизод "Очень странных дел", ибо там на 28ой минуте ленту наматывают прямо на перчатку, что на корню херит весь смысл:



4) На ступни натягиваются отдельные одноразовые бахилы, вдобавок ко вшитым в костюм.

5) На запястья натягиваются одноразовые нарукавники.

6) Надевается вторая пара одноразовых перчаток, имеющих отличный от первой пары цвет.

7) Для защиты дыхательных путей и волос было два возможных варианта:
- либо респиратор N95 (индекс означает, что тот способен фильтровать 95% частиц размером в 0.3мкм), и капюшон или сеточка
- либо powered air-purifying respirator (далее "PAPR"). Принцип работы оного несложен: компрессор на поясе гонит фильтрованный воздух через шланг в верхней части капюшона, создавая в капюшоне избыточное давление, и мешая болезнетворным микроорганизмам туда попасть.

Вот я во всем этом добре, и в PAPR. Фотография сделана до входа в "горячую зону", перчатки пока ещё чистые, так что то, что я держу в руке свой телефон -- нормально.



А респираторы N95 я не любил. Во-первых, в самом начале мне примеряли различные модели респираторов, и первые два пропускали воздух во время теста, что не прибавило мне доверия к этому методу защиты. Тест там любопытный -- на плечи опускают закрытый сверху пластиковый цилиндр, и пшикают внутрь каким-то газом; если во рту чувствуется горечь -- маска течет. Причем без этого теста мне было очень трудно понять, течет ли она, так что привет людям, купившим из-за паники кучу респираторов N95 без всякой примерки. Во-вторых, мне было психологически некомфортно быть в "горячей зоне" с частично открытым лицом, пусть умом я и понимал, что опасность околонулевая. В-третьих, от этих дурацких тесемок у меня к концу дня начинали болеть уши. Но при работе с микроскопом приходилось надевать этот респиратор, что поделаешь, иначе трудно смотреть в окуляр. А некоторые у нас всё время в таком респираторе рассекали, им так больше нравилось:



У новичка надевание всей этой защиты занимает где-то 15-20 минут. У опытного человека -- несколько минут. Если надо выйти, например, в туалет, придется всё снимать, и потом надевать по новой.

Входим в "горячую зону"

Итак, защита надета. После этого открывается дверь в помещение 3 (снова приведу схему); при этом дверь между помещениями 1 и 2 блокируется, чтобы никто по ошибке не открыл её, пока открыта дверь в "горячую зону".



В зоне 3 был душ, кстати, но мы им никогда не пользовались. Когда лабораторию только начинали планировать, еще были свежими воспоминания о терактах 2001 года, так что она подготовлена к работе с более суровыми вещами чем "простой" туберкулез, например с сибирской язвой -- там пришлось бы принимать душ при каждом выходе из "горячей зоны"

В целях безопасности, в лаборатории всегда поддерживается т.н. отрицательное давление воздуха, т.е. давление воздуха чуть ниже атмосферного, чтобы обеспечить направленный поток воздуха в лабу, и предотвратить утечку тамошнего воздуха в коридор -- воздух снаружи постоянно подсасывался внутрь сквозь всякие там щели в дверях и т.п., дабы потом пройти через HEPA фильтры. Так что перед заходом в "горячую зону" также обязательно надо проверить, что показывает датчик разницы давления -- табло там прямо у двери.



После коридора мы попадаем в зону четыре со схемы выше. Тут стоят холодильники с образцами и лежат запасы всякого-разного (на фото их нет, но сейчас полки под окном заполнены всякой всячиной). Само окно нужно, чтобы была возможность видеть происходящее в лаборатории, не заходя туда. Правда, такие окна были далеко не во всех помещениях.



Через двери на фотографии выше мы можем попасть в комнаты с кабинетами биозащиты. Вот одна из них (цифра 5 на схеме выше). Снова отметьте окно:



Работа с биоматериалом

Предположим, что в инкубаторе у нас дозрела культура туберкулезного штамма H37Rv, и настала пора сделать с ней что-нибудь эдакое. Несмотря на то, что уже после "тамбура" вся лаборатория считается "горячей зоной", самая грязная работа производится в кабинетах биозащиты, которые стоят у левой стены на фотографии выше. Внутри кабинета создается идущий в вертикальном направлении ламинарный поток воздуха, в который подсасывается воздух снаружи кабинета, и потом этот воздушный поток проходит через HEPA фильтр.



Перед началом работы, т.е. перед тем как открыть мензурку с культурой, кабинет нужно определенным образом подготовить. Ниже фотография времён моего обучения, запечатлена моя начальница. Защиты на ней нет, потому что вся лаборатория тогда была "холодной", т.е. обеззараженной -- такое делается два раза в год, чтобы в течении нескольких недель провести обслуживание и ремонт оборудования, добавить что-то новое, обучать новичков в щадящих условиях, и так далее. Я помню, у нас однажды забарахлил микроскоп где-то через месяц после обслуживания. Лаба к тому времени была "горячей" и пригласить туда технарей из компании-производителя было нельзя -- ну, точнее, это было сопряжено с весьма большими сложностями. Так что я занимался сложной починкой и наладкой в своих двойных перчатках, получая ЦУ по скайпу. Удовольствие ниже среднего, прямо скажем.



Обратите внимание на клеенку, и на синие микропипетки -- последние всё время лежат в кабинете, ибо полностью продезинфицировать их весьма трудно. Еще обратите внимание на кисти рук, видны обе пары перчаток -- внешние (синий цвет, нитрил) и внутренние (бежевый цвет, латекс). Руки должны все время быть там, в кабинете. Если их надо оттуда вынуть, то сначала надо снять внешние перчатки, замочить их в антисептике, выбросить, и только после этого вынимать руки -- причем, надо тут же снова надеть новую пару внешних перчаток, дабы не забыть.

Вот еще одна фотография, уже "боевая". Расстелена клеенка. Есть два красных мешка для мусора, один из них для колюще-режущих отходов. В правом нижнем углу видна баночка с антисептиком, в которой вымачивается специальная тряпочка, еще одна пропитанная антисептиком тряпка расстелена поверх клеенки. Хорошо видно, куда идет шланг PAPR. Ну и отметьте, что запястья не лежат на передней решетке, ибо это блокирует воздух и нарушает ламинарное течение оного -- руки надо держать на весу, уперев локти в серый подлокотник. Что там, не рекомендуется даже резко двигать руками из стороны в сторону, ибо это также делает поток воздуха турбулентным.



Эта часть работы лично для меня была самой сложной -- всё время надо отдавать себе отчёт, где твои руки, что ты сейчас делаешь, чего касаешься. В среднем, работа в кабинете биозащиты для отдельно взятого эксперимента занимала у меня несколько часов (а это еще мало, иные там весь день проводят). И если в это время забыться хоть на секунду и, например, выдернуть из кабинета руку во внешней перчатке -- всё, это ЧП. Придется срочно сказать всем присутствующим выметаться из комнаты на два с половиной часа (дабы точно осела плавающая в воздухе дрянь), заполнить отчет о происшествии, получить ласковый нагоняй от начальства, и так далее.

В общем, работа эта весьма педантична, она не терпит коекакеров и торопыг. Вместе со мной обучение проходил умный, но чересчур самоуверенный профессор -- и он не прошел экзамена, не был допущен к работе в BSL-3.

Обеззараживание и выход

После окончания эксперимента надо вычистить кабинет биозащиты и избавиться от мусора -- оставить кабинет нечищенным это жуткий косяк, в этой лабе я такое видел всего пару раз, и каждый раз устраивал разбор полётов. Отходы аккуратно собираются в мешок в определенной последовательности, все поверхности в кабинете тщательно вытираются спец.тряпкой с антисептиком, и так далее. После этого можно включить в кабинете УФ излучение для дополнительной стерилизации поверхностей.

Мешки с мусором относят в комнату с автоклавом (приспособление, которое стерилизует биоотходы большой температурой и давлением), у нас он был в помещении 6 на схеме:



Мусор помещают в специальные пластиковые бочки с крышками, и ставят те в автоклав. Фотографий нашего автоклава я в интернете не нашел, но этот вроде похож -- у нас тоже была такая "рельсовая" система:



Обратите внимание, на схеме автоклав сообщается в комнатой снаружи -- там из вышеупомянутых бочек достают уже стерилизованные мусорные мешки, и складывают их в кучу; раз в неделю их оттуда забирает занимающаяся отходами компания. Автоклав запрограммирован так, чтобы внешняя дверь открывалась только после прохожения полного цикла стерилизации. До кучи, в каждую бочку заранее кладется специальная термочувствительная полоска, которая определенным образом меняет цвет когда цикл проходит успешно. У нас вот одно время была проблема, когда автоклав чудил, и полоски меняли цвет не совсем так, как надо было. Это тоже ЧП, которое приходилось документировать.

Итак, мусор убран, осталось уйти. Перед выходом из помещения 4 надо брызнуть спреем с антисептиком на ступни, на запястья, и на руки. Снимаются и выкидываются внешние перчатки, нарукавники и внешняя пара бахил. Ещё одна обработка спреем. Потом, уже в "тамбуре" снимается PAPR и костюм, последними снимаются и выкидываются внутренние перчатки. Всё! Можно идти и квасить работать над анализом данных.

Заключение

Извиняюсь, если написано слегка сумбурно, мне трудно было решить, что именно стоит описывать, и с какими подробностями. Если что-то осталось непонятым, или интересны дополнительные подробности -- спрашивайте в комментариях, буду рад ответить.

Ну и если вернуться к началу заметки, где упомянуты обвинения китайцев в небрежности -- как видите, в подобных лабораториях очень много держится на личной ответственности и аккуратности исполнителей. Являются ли такими все работники уханьской лаборатории? Не знаю. Но скажу честно, на основании личного опыта у меня сложилось впечатление, что приехавшие из Китая аспиранты-биологи не прочь срезать углы. Помню, у нас в соседней лабе пришел как-то утром народ, и охренел -- винда на контролирующем многомиллионный микроскоп компьютере вдруг вся стала на китайском языке. Оказалось, какой-то китайский аспирант-первогодка работал ночью, не смог сделать что-то нужное, и, недолго думая, переустановил винду на компе на тут же скачанную через университетский интернет китайскую пиратку.

В общем, лично я с самого начала подозревал именно утечку из лаборатории, и сейчас всё так же считаю эту версию наиболее вероятной.

Бонус

Ниже результат одного из моих экспериментов. Это не туберкулезные палочки, всего лишь M. smeg, но клетки у них выглядят примерно одинаково. Вкратце, замысел тут такой: колония какое-то время растет в благоприятных условиях, затем туда на шесть часов добавляется антибиотик рифампицин, а потом он убирается и мы смотрим  -- какие бактерии смогли снова начать расти после воздействия антибиотика, а какие нет. Помнится, в вышеупомянутой публикации в PNAS у меня была база данных с тысячей клеток, с информацией по длине бактерий и т.п. для каждого отдельно взятого кадра. Я всё это добро анализировал в матлабе, пытаясь выяснить, какие фенотипные характеристики бактерий коррелируют с устойчивостью к антибиотикам, и таки накопал кое-какие интересные связи. Продолжительность этой записи -- около суток (а для тубика такие записи вообще занимали целую неделю).


Tags: биология, наука
Subscribe
  • Post a new comment

    Error

    default userpic

    Your IP address will be recorded 

    When you submit the form an invisible reCAPTCHA check will be performed.
    You must follow the Privacy Policy and Google Terms of use.
  • 102 comments
Previous
← Ctrl ← Alt
Next
Ctrl → Alt →
Previous
← Ctrl ← Alt
Next
Ctrl → Alt →